如何做標(biāo)準(zhǔn)方法的驗證？

如何做標(biāo)準(zhǔn)方法的驗證？

圣賓儀器科技上海有限公司

方法驗證是指實驗室通過核查，提供客觀有效證據(jù)證明自身滿足檢測方法規(guī)定要求的過程，即證實該方法能在該實驗室現(xiàn)有的設(shè)施設(shè)備、人員、環(huán)境等條件下獲得令人滿意的結(jié)果，適用于實驗室新引入的標(biāo)準(zhǔn)方法。

方法驗證過程中關(guān)鍵的參數(shù)取決于方法的特性和可能測到的樣品基質(zhì)的檢測范圍，至少應(yīng)測定準(zhǔn)確度和精密度。對于痕量化學(xué)分析實驗室，實驗室還應(yīng)確保獲得適當(dāng)?shù)臋z出限(LOD)和定量限(LQD)。通常情況下定量分析方法驗證的參數(shù)包括但不限于檢出限、定量限、選擇性、線性范圍、精密度（重復(fù)性和再現(xiàn)性）、準(zhǔn)確度。

一、檢出限

用特定分析方法在給定的置信度內(nèi)可從樣品中定性檢出待測物質(zhì)的zui低濃度或最小量即為方法的檢出限。方法檢出限的計算和表達(dá)方法有很多，常見的包括空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法、信噪比法、逐步稀釋法等。同一個檢測指標(biāo)不同的檢出限表達(dá)結(jié)果差異可能會達(dá)到幾個數(shù)量級。實驗室在選擇檢出限的表示方法時，應(yīng)盡可能的研究多種表示方法，對比結(jié)果，選擇最佳的方法來表示該方法的檢出限。如果檢測方法中已給方法檢出限，則在給出的方法檢出限濃度水平上，通過分析該濃度水平的樣品，用以驗證給出方法檢出限，分析結(jié)果應(yīng)在給出的方法檢出限±20%范圍內(nèi)；若方法未給出檢出限，實驗室則應(yīng)選擇一個適當(dāng)?shù)姆椒ㄑ芯考坝嬎惚硎尽Ｏ旅嬖敿?xì)闡述各種方法檢出限的計算表達(dá)方式。

1、空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法（適用于光譜法檢測）

按照樣品分析的全部步驟，重復(fù)n（n≥7）次空白試驗，將多次測定結(jié)果換算為樣品中的濃度或含量，計算n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按公式計算方法檢出限。

MDL= t (n 1,0.99)×S

MDL——方法檢出限；

n——樣品平行測定的次數(shù)；

t——自由度為n-1，置信度為99%時的t分布（單側(cè)）；

S——n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差

其中，當(dāng)自由度為n -1，置信度為99% 時的t 值可參考表取值

平行測定次數(shù)（n）	自由度（n-1）	t (n 1,0.99)
7	6	3.143
8	7	2.998
10	9	2.821
11	10	2.764
16	15	2.602
21	20	2.528

2、信噪比法（適用于色譜法檢測）

對空白樣品加入一定濃度（一般為估計的方法檢出限）的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照樣品分析的全部步驟進(jìn)行試驗，計算儀器上待測物與噪聲的信號比值，若信噪比S/N＞3時，則進(jìn)一步減少加標(biāo)濃度，反之則增加加標(biāo)濃度重新進(jìn)行試驗。當(dāng)信噪比S/N＝3時，則對應(yīng)的樣品濃度為該方法的檢出限，按公式計算方法檢出限。

MDL=S/b

S——儀器噪音的3倍，即儀器能辨認(rèn)的最小的物質(zhì)信號；

b——校準(zhǔn)曲線回歸方程中的斜率；

3、最小液滴體積法（適用于滴定法檢測）

一般根據(jù)所用的滴定管產(chǎn)生的最小液滴的體積來計算，按公式計算方法檢出限。

MDL= kλρV0M1/ M0V1

λ——被測組分與滴定液的摩爾比；

ρ——滴定液的質(zhì)量濃度，g/ml；

V0——滴定管所產(chǎn)生的最小液滴體積，ml；

M0——滴定液的摩爾質(zhì)量，g/mol；

V1——被測組分的取樣體積，ml；

M1——被測項目的摩爾質(zhì)量，g/mol；

k——當(dāng)為一次滴定時，k＝1；當(dāng)為反滴定或間接滴定時，k＝2。

二、定量限

在限定誤差能滿足預(yù)定要求的前提下，用特定方法能夠準(zhǔn)確定量測定待測物質(zhì)的zui低濃度或最小量即為方法的定量限。一般取3~4倍的方法檢出限作為方法的定量限。

三、選擇性

選擇性是指用某種分析方法測定某組分時，能夠避免樣品中其他共存組分干擾的能力。如果方法已提供了干擾情況的所有信息，則實驗室無需對干擾情況采取進(jìn)一步的研究。如果方法未提供干擾情況的信息或信息不完整，則須對可能存在的干擾情況進(jìn)行研究。

對于化學(xué)分析方法，在有干擾的情況下，如：基質(zhì)成分、代謝物、降解產(chǎn)物、內(nèi)源性物質(zhì)等，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，實驗室可使用但不限于下述兩種方法檢查干擾：

方法1：分析一定數(shù)量的代表性空白樣品，檢查在目標(biāo)分析物出現(xiàn)的區(qū)域是否有干擾（信號、峰等）；

方法2：在代表性空白樣品中添加一定濃度的有可能干擾分析物定性和/或定量的物質(zhì)。

四、線性范圍

對于分析方法而言，用線性計算模型來定義儀器響應(yīng)與濃度的關(guān)系，該計算模型的應(yīng)用范圍即為線性范圍。在對標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行線性及校準(zhǔn)驗證時，應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)文件規(guī)定的各個濃度點配制校準(zhǔn)曲線，以驗證儀器的測定上限及下限是否能滿足標(biāo)準(zhǔn)文件所規(guī)定的線性范圍，以及由此得到的相關(guān)系數(shù)r是否滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

五、精密度

在規(guī)定條件下，多次獨立測試結(jié)果間的一致程度即為精密度。精密度包括重復(fù)性和再現(xiàn)性，一般采取有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測定。實驗室zhi定某一名檢測人員對高、中、低三種不同含量水平（高、中、低三種含量水平建議依次為10倍定量限、2倍定量限、定量限）的同一樣品，按樣品處理程序每個樣品平行測定6次，分別計算不同濃度或含量樣品的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等各項參數(shù)，計算結(jié)果應(yīng)小于或等于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的重復(fù)性限r。

六、準(zhǔn)確度

檢測結(jié)果與樣品真值間的一致程度即為準(zhǔn)確度，一般采用測定有證標(biāo)準(zhǔn)樣品或加標(biāo)回收試驗進(jìn)行評估驗證。若實驗室使用有證標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度驗證，則需對對3個不同含量水平（含量水平的選擇見“五、精密度"）的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測定，每個有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品按全程序平行測定6 次，分別計算不同濃度或含量水平有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對誤差等各項參數(shù)。若實驗室對實際樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗進(jìn)行準(zhǔn)確度驗證，則需對每個樣品類型的不同含量水平的統(tǒng)一樣品中分別加入一定量的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測定，每個加標(biāo)樣品按全程序平行測定6次，分別計算每個統(tǒng)一樣品的加標(biāo)回收率。

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